Transformation kallas det för när genetiskt material introduceras in i bakterier. Detta kan ske antingen naturligligt eller genom att följande steg! Detta protokoll beskriver hur du i labbet kan transformera plasmider in i Escherichia coli bakterier.

1. Förberedelser

För denna laboration kommer förberedandet av följande krävas:

Klicka på valfri lösning eller agar för att hitta protokoll och läsa mer om hur du förbereder de. 

2. Plasmid Transformation

Procedur

1. Låt  -80 °C alikvoten tina långsamt på is. Se till att kyla toma Eppendorf-rör på is, samt värma SOC till 37 °C.

2. När alikvoten har tinat blanda den försiktigt med pipett och för över 50 uL bakterier i varje kylt rör.

3. Tillsätt 10 µL 5x KCM till varje rör.

4. Inkubera celler på is i 10 minuter.

5. Tillsätt 5 µL plasmid och virvla rören försiktigt för att säkerställa en god blandning.

6. Inkubera på is i 30 minuter.

7. Om du använder topp 10-celler: värmepulsera i 60 sekunder, 42 °C. Om du använder BL21-celler: värmepulsera i 15 sekunder, 42 °C.

8. Inkubera celler på is i 2 minuter.

9. Tillsätt 100 µL förvärmd SOC till varje rör.

10. Inkubera cellerna på en skakare i 1-2 timmar (37 °C, 200-250 rpm). Se till att förvärma agar plattor med relevant antibiotika för selektion i inkubatorn.

11. För över 135 μL bakterie-blandning (blanda försiktigt med pipett) till en agarplatta med antibiotika och sprid bakterierna jämnt. Återstående celler kan spridas på en antibiotikafri platta för att kontrollera cellens viabilitet.

12. Inkubera agarplattor över natten (max 18 h, leta helst efter kolonier efter 12 h).


0 kommentarer

Lämna ett svar

E-postadressen publiceras inte. Obligatoriska fält är märkta *